- 代昕宇;李昀真;孙亚杰;胡博;张成琪;许丽文;白雪;
为研发高免疫原性的新型狂犬病颗粒样疫苗，利用PCR方法扩增狂犬病病毒HEP-Flury株的G蛋白和M蛋白基因序列，将其依次克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统穿梭载体pFastBac dual上，构建重组质粒pFD-GM。制备基于pFD-GM的重组杆粒，转染至Sf9细胞，得到重组杆状病毒rb-GM,在Sf-9细胞中表达获得病毒样颗粒VLP-GM。经SDS-PAGE、Western blot和间接免疫荧光鉴定，重组杆状病毒成功表达了G蛋白(约56 kDa)和M蛋白(约23 kDa);经电镜观察，VLP-GM大小约为100 nm×50 nm,呈表面带有纤突的子弹形状，与典型的狂犬病病毒粒子类似。将VLP-GM免疫犬，经测定犬在二次免疫后产生较灭活疫苗更高的中和抗体水平，达到7.81 U/mL,并且与单独免疫G蛋白相比可刺激更多细胞因子如白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)生成。本研究成功表达了狂犬病病毒的病毒样颗粒VLP-GM,证明了其免疫原性，为后续的疫苗研制和抗体制备奠定了基础。
2024年07期 v.56;No.468 44-51页 [查看摘要][在线阅读][下载 1603K] [下载次数：387 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：2 ] - 王彦伟;岳亚男;张素玲;李欢欢;陈赵媛;刘月月;逄文强;田克恭;
C129R和E165R分别是非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组编码的一种Mn依赖的超氧化物歧化酶和尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶，2种酶均参与ASFV的复制过程。通过研究ASFV C129R蛋白与E165R蛋白的功能，以指导非洲猪瘟的诊断及免疫预防研究。对ASFV SY-18株的C129R和E165R基因序列进行密码子优化后，利用大肠杆菌进行表达，纯化后获得重组蛋白，通过Western blot鉴定其反应性，并对其胞外酶活力进行测定，对C129R蛋白的结构预测结果进行分析。结果：实现了C129R蛋白与E165R蛋白的可溶性表达，重组蛋白分子量分别约为15 kDa和18 kDa, Western blot显示C129R与E165R蛋白均能与ASFV阳性血清产生特异性反应；胞外酶活力测定显示，C129R与E165R蛋白在胞外均有酶学活性，比酶活力分别为(60.2±3.8) U/mg和(32.6±2.4) U/mg;蛋白质结构预测结果显示，C129R为双结构域蛋白，主要由N端α螺旋结构域和C末端α/β结构域组成，C129R蛋白N端α螺旋结构域和C末端α/β结构域的交界处可能是其主要活性位点，序列保守的β-折叠桶(K_(32)～A_(101))可能在其发挥功能时起重要作用。
2024年07期 v.56;No.468 52-57页 [查看摘要][在线阅读][下载 1187K] [下载次数：350 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 余紫葳;蒋艳妹;宋金祥;崔德福;刘永相;范春艳;
为了探究猫疱疹病毒(FHV)在邯郸地区的分子流行病学特征，从邯郸地区不同动物医院收集到有呼吸道症状猫的眼、鼻分泌物共55份，经PCR初检后，将阳性样本接种于猫肾细胞(CRFK),细胞产生病变，经过蚀斑纯化、分子生物学检测、血清学鉴定、病毒形态鉴定，得到1株FHV。用gD基因引物扩增FHV分离株基因后能够得到特异性条带，且经过3轮蚀斑纯化后，得到1株亚克隆毒株，命名为FHV HD1。FHV HD1 P3代在CRFK上的病毒滴度为10~6 TCID_(50)/100μL,并检测生长过程中8个时间点的病毒滴度，绘制分离株生长曲线。使用FHV-1特异性抗体进行间接免疫荧光检测，结果FHV HD1能够出现特异性荧光。BLAST分析表明FHV HD1株gD基因与其他FHV-1相似性达98.25%～99.91%。进化树分析表明与猫科动物源FHV-1亲缘关系较近，处于同一大分支，与犬疱疹病毒和其他动物疱疹病毒亲缘关系较远。本研究结果为FHV的进化分析和现阶段疫苗研发奠定了基础，对猫病毒性鼻气管炎的病原学、免疫学、临床诊断及分子生物学的研究具有重要参考价值。
2024年07期 v.56;No.468 58-64页 [查看摘要][在线阅读][下载 1215K] [下载次数：539 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 寇美玲;孟锦昕;苗海生;李乐;谢佳芮;高林;廖德芳;李华春;宋建领;
旨在获取中国帕利亚姆血清群中山病毒(Chuzan virus, CHUV)毒株的全基因组序列并分析其遗传特征。应用BHK-21、Vero、MDBK细胞对云南省江城县采集的152份健康黄牛血液样品盲传分离病毒，针对出现细胞病变样品，采用CHUV VP7蛋白基因片段进行RT-PCR扩增和测序，并对阳性样品进行全长扩增及高通量测序，获得的全基因组序列进行遗传进化分析。结果：1份血液样品可致BHK 21、Vero、MDBK细胞病变；病毒基因组为10节段的“3-3-3-1”带型；病毒基因全长18 914 bp,各基因节段长度在728 bp(Seg-10)～3 930 bp(Seg-1)之间，编码6 072个氨基酸残基，编码蛋白在211(NS3蛋白)～1 295(VP1蛋白)个氨基酸残基之间；通过对保守基因Seg-1,Seg-3、Seg-7的核苷酸系统发育分析，显示与中国本土CHUV亲缘关系最近，为98.17%～99.65%,形成一簇；变异基因Seg-2的核苷酸序列同样与中国本土CHUV毒株相似度最近，为98.76%～99.57%。本研究表明中国CHUV毒株的Seg-1、Seg-3和Seg-7形成了独特的地域型，为深入揭示我国CHUV的致病性和病原学特征提供了基础数据。
2024年07期 v.56;No.468 65-71页 [查看摘要][在线阅读][下载 1522K] [下载次数：69 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 孙心如;孙敏;周洪婷;李素芬;张雪寒;周金柱;贡嘎;索朗斯珠;李彬;
旨在优化G6P[1]型牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)在MARC-145细胞中的培养条件，制备其兔源多克隆抗体，并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。对G6P[1]型BRV毒株NCDV进行不同病毒接种量及收毒时间优化，确定病毒在MARC-145细胞中的最佳培养条件；以1×10~7 TCID_(50) NCDV活毒作为免疫原免疫成年兔，制备兔源多克隆抗体；通过间接ELISA检测多抗效价，并通过间接免疫荧光试验(IFA)及中和试验鉴定其特异性。结果：NCDV毒株以感染比0.1、感染时间24 h为最佳培养条件，病毒滴度可至4.9×10~6 TCID_(50)/mL;间接ELISA结果显示，多克隆抗体的效价为1∶51 200,表明NCDV具有良好的免疫原性；IFA及中和试验结果表明，NCDV多克隆抗体与G6P[1]型、G9P[1]型和G10P[11]型BRV毒株均能发生特异性反应，存在良好的交叉中和效应，表明制备的多抗具有良好的反应性。综上，本试验成功优化了NCDV毒株在MARC-145细胞中的增殖条件，并制备了高效价的兔源多克隆抗体，为后续BRV感染的血清学诊断及疫苗研发奠定了理论基础。
2024年07期 v.56;No.468 72-77页 [查看摘要][在线阅读][下载 1277K] [下载次数：482 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：2 ] |[阅读次数：1 ] - 刘晓艳;王永飞;邓博文;哈尔勒哈·阿曼太;蔡江;李有文;
旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等；采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到30S rpsE基因片段，经NdeⅠ、XhoⅠ酶切纯化后，将其连接到pET-42b载体上，构建原核表达载体pET-42b-30S rpsE,使用不同浓度IPTG诱导蛋白在大肠杆菌BL21中表达；重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定，用镍层析法纯化蛋白后，与弗氏佐剂1∶1混合注射免疫家兔，然后采取全血，检测血清抗体效价及特异性。结果：经预测30S rpsE蛋白是亲水无信号肽的膜外蛋白，无跨膜结构域，有一个糖基化位点；成功构建了原核表达载体pET-42b-30S rpsE,表达的重组蛋白分子量约为25.9 ku,以包涵体和可溶性的形式存在；免疫家兔后血清抗体效价为1∶25 600,证实30S rpsE蛋白具有较好的免疫原性。
2024年07期 v.56;No.468 78-84页 [查看摘要][在线阅读][下载 1321K] [下载次数：280 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ] - 范汝慧;白乾坤;泮欣铭;刘嘉楠;马家乐;于勇;姚火春;
胞壁相关蛋白A(WapA)广泛存在于革兰阳性菌中，在细菌致病过程中发挥重要作用。为探究WapA的致病机制和致病作用，本研究对猪链球菌WUSS351株基因组进行分析，发现了2个编码WapA毒素的基因簇，编码的毒素分别命名为WapA1和WapA2,在GenBank数据库中检索到更多的WapA1和WapA2同源体，通过对它们的C端和N端结构域的系统进化分析，发现猪链球菌中广泛存在编码该毒素的基因簇，提示其可能具有重要的功能。后续通过构建多个WapA毒素的pBAD-His和pBAD-pleB重组质粒在大肠杆菌中表达WapA,结合生长曲线与活菌计数结果发现，WapA1-1对大肠杆菌具有周质毒性，而WapA1-2、WapA1-3、WapA2-1、WapA2-3对大肠杆菌具有胞质毒性，初步确定了WapA的毒性作用。进一步构建wapA1-1、wapA1-2、wapA2-1、wapA2-3基因缺失株(ΔwapA1-1、ΔwapA1-2、ΔwapA2-1、ΔwapA2-3),并通过竞争试验和动物感染试验发现，WapA可介导猪链球菌WUSS351株的竞争生长，并在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。本研究结果对于猪链球菌的致病机理研究具有指导意义，为后续疾病治疗和预防提供参考。
2024年07期 v.56;No.468 85-94页 [查看摘要][在线阅读][下载 2876K] [下载次数：190 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：0 ] |[阅读次数：1 ] - 贺紫琴;宁李纳;范杰;凌同;刘甜甜;李欣;陈志雄;黎满香;葛猛;
旨在构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆，并利用双抗体夹心ELISA对拯救病毒进行鉴定。通过PCR从阳性病料中扩增出PCV2两种基因型2b与2d的全基因组DNA,并分别克隆入pMD-19T载体，获得2个重组质粒，命名为p19T-PCV2b与p19T-PCV2d。利用SacⅡ酶切获得l 767 bp的PCV2全基因组，并在体外分别用T4连接酶连接而环化，将环状基因组转染至PK-15细胞，传至P6代，利用间接免疫荧光试验(IFA)对拯救病毒进行鉴定，结果表明PCV2b与PCV2d感染性克隆可拯救出病毒。利用PCV2单克隆抗体(单抗)作为捕获抗体，用辣根过氧化酶(HRP)标记的PCV2多抗作为检测抗体，建立检测PCV2病毒粒子的双抗体夹心ELISA方法，用于PCV2拯救病毒的鉴定。将该检测方法与IFA和半数组织细胞感染量(TCID_(50))结果进行对比分析，结果显示，ELISA检测值与Image-J所计算的IFA荧光强度及TCID_(50)的相关系数分别达到0.7和0.8以上，说明该方法与IFA及TCID_(50)检测结果均具有较强的一致性，可以用于PCV2拯救病毒的快速鉴定。
2024年07期 v.56;No.468 95-101页 [查看摘要][在线阅读][下载 1070K] [下载次数：571 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：3 ] |[阅读次数：1 ] - 张晓婷;郑一青;曾亦然;常丽凤;陈纳;卢渊录;罗皓炜;高紫荷;平继辉;
环状RNA(circRNA)已被证明在众多生物过程中起着重要的调控作用，而circRNA在甲型流感病毒(IAV)复制过程中的功能尚不清楚。本研究旨在利用高通量测序分析IAV感染A549细胞后的circRNA表达谱变化来挖掘能够影响病毒复制的circRNAs并对其进行初步功能鉴定。利用测序结果，对全部circRNAs进行特征分析、差异表达筛选；对差异circRNAs进行GO分析、KEGG分析；对候选circRNAs进行qPCR、RT-PCR验证及Sanger测序鉴定，并通过空斑试验确定影响病毒复制的circRNAs。结果：本试验共筛选到11 630条差异表达circRNAs,对其中6条circRNA进行了鉴定，最终确定novel＿circ＿007428具有抗病毒作用。本研究对甲型流感病毒感染A549细胞后的circRNA表达谱进行了分析与鉴定，为进一步研究circRNA在流感病毒感染中发挥的调控作用奠定了基础。
2024年07期 v.56;No.468 102-111页 [查看摘要][在线阅读][下载 1864K] [下载次数：323 ] |[网刊下载次数：0 ] |[引用频次：1 ] |[阅读次数：1 ]